Senėjimo ląstelių - galaktozidazės dažymo rinkinys

Daugumos normalių ląstelių dalijimosi gebėjimas yra ribotas. Kai jie negali dalytis, jie patenka į senėjimo būseną, kuri vadinama ląstelių senėjimu. Ląstelių senėjimas yra garantinis mechanizmas ląstelei kontroliuoti savo augimo potencialą, o tai paprastai reiškia replikacinį senėjimą. Normalios ląstelės nustoja dalytis po riboto dalijimosi skaičiaus ir įvyksta negrįžtamas augimo sustojimas. Šiuo metu ląstelės vis dar gyvos, tačiau yra reikšmingų ląstelių morfologijos ir fiziologinio metabolinio aktyvumo pokyčių, kuriuos paprastai reiškia didesnis ląstelių tūris ir -galaktozidazės aktyvacija, susijusi su senėjimu. -galaktozidazė yra hidrolizinis fermentas ląstelių lizosomose. Paprastai jis aktyvus, kai pH yra 4.0, bet jis yra aktyvus, kai pH 6.0 senstančiose ląstelėse. Šis rinkinys yra pagrįstas šiuo reiškiniu ir principu, skirtu nudažyti senstančius audinius ar ląsteles nuo su senėjimu susijusio galaktozidazės aktyvumo lygio reguliavimo. Specifinis reakcijos principas yra tas, kad X-Gal naudojamas kaip substratas, o senstančios ląstelės specifinė -galaktozidazė katalizuoja substratą, kad susidarytų mėlynas produktas, kurį ląstelės citoplazmoje vaizduoja mėlynos nuosėdos, kurias galima stebėti šviesos mikroskopu. . Remiantis skaičiavimais, kad dažymo tirpalo kiekis kiekvienam mėginiui yra 1 ml, rinkinys gali užbaigti 100 mėginių dažymą.

Šlapio ledo transportavimas; Laikyti 2-8 laipsnio atokiau nuo šviesos, galioja 12 mėnesių. Jei X-Gal milteliai ruošiami į tirpalą, jie padalijami į mažas dalis ir laikomi -20 laipsnių temperatūroje, o tai suveikia per 3 mėnesius.

Reagentų paruošimas

1. Paruoškite savo PBS buferį (Rekomenduojamas G4202).

2. 100 mg X-Gal milteliai buvo visiškai ištirpinti ir sumaišyti su 5 ml DMF (dimetilformamido), tada padalinti į 1,5 ml švarius centrifugavimo mėgintuvėlius, po 0,5 ml kiekvienam mėgintuvėliui, ir laikyti {{8} } laipsnių atstumu nuo šviesos. Venkite pakartotinio užšaldymo ir atšildymo.

3. -galaktozidazės dažymo tirpalo paruošimas pagal toliau pateiktoje lentelėje pateiktą proporciją. Ląstelėms, kultivuotoms 6-šulinėlių plokštelėse, vienai duobutei reikia 1.0-1,5 ml dažymo darbinio tirpalo, o 12-šulinėlių plokštelėse - 0.{{8} }}.0 Vienai duobutei reikia dažymo darbinio tirpalo. Dažymo tirpalas buvo paruoštas pagal mėginio dydį, kad būtų išvengta švaistymo.

1. Prilipusioms ląstelėms

(1) Kultivuotos ląstelės (arba ląstelių nuskaitymo lakštai) 6-šulinėlių plokštelėse buvo išsiurbtos, ląstelių auginimo terpė pašalinta, du kartus plaunama PBS ir pridėta 1 ml -galaktozidazės dažymo fiksuojančio tirpalo, o ląstelės fiksuotas 15 min kambario temperatūroje.

(2) Fiksuotas tirpalas buvo išmestas, o ląstelės buvo plaunamos PBS 3 kartus, kiekvieną kartą po 2 minutes.

(3) PBS buvo pašalintas nusiurbiant pipete, į kiekvieną šulinėlį įpilama 1 ml -galaktozidazės dažymo darbinio tirpalo ir inkubuojama 37 laipsnių temperatūroje nuo 2 valandų iki nakties. Pastaba: Neinkubuokite anglies dioksido inkubatoriuje 37 laipsnių temperatūroje. Dažymo metu reikia laiku stebėti spalvos vystymąsi. Jei -galaktozidazės ekspresija mėginyje yra didelė, dažymas gali būti baigtas per kelias valandas. Jei -galaktozidazės ekspresija buvo maža, inkubacijos laikas turėtų būti atitinkamai pratęstas, per kurį 6-šulinėlių plokštelė turi būti užsandarinta plastikine plėvele arba parafilma, kad skysčio išgaravimas nepakenktų dažymo rezultatams.

(4) Įprastu šviesos mikroskopu dažymo tirpalas buvo pašalintas po to, kai teigiamos ląstelės įgijo spalvą. Jei branduolius reikia priešdažyti, įpilkite nedidelį kiekį Nuclear Fast Red tirpalo (Rekomenduojamas G1035) į šulinio plokštelę, kad uždengtumėte ląsteles ir dažykite kambario temperatūroje 3 min., pašalinkite dažymo tirpalą ir keletą kartų plaukite PBS.

(5) 2 ml PBS buvo pridėta, kad padengtų ląsteles, ir dažymas buvo baigtas. Mėginį galima laikyti 4 laipsnių temperatūroje 1 savaitę. Arba įpilkite 70% glicerolio, kad padengtumėte ląsteles, 4 laipsniai gali būti laikomi ilgą laiką. Jei tai yra ląstelių laipiojimo lapas, laipiojimo lapas gali būti visiškai išdžiovintas, ksilenas skaidrus numetus neutralų gumos sandarinimo lakštą, gali būti laikomas ilgą laiką.

2. Užšaldytiems skyriams

(1) 10 min. pašildykite užšaldytas dalis kambario temperatūroje. Apsukite audinį audinių potėpiais.

(2) Į audinį buvo pridėtas tinkamas kiekis -galaktozidazės dažymo fiksuojančio tirpalo, kad jis visiškai padengtų audinį, ir tirpalas fiksuotas kambario temperatūroje 20 min.

(3) Audinių sekcijos buvo mirkomos ir plaunamos PBS 3 kartus, kiekvieną kartą po 5 minutes.

(4) Pjūviai buvo patalpinti į šlapią dėžę, kad būtų išvengta šviesos, ir į audinį buvo įpiltas atitinkamas kiekis -galaktozidazės dažymo tirpalo, kad audinys visiškai padengtų. Drėgna dėžutė buvo inkubuojama 37 laipsnių temperatūroje, o spalvos raida buvo stebima mikroskopu kas 2 valandas. Jei spalvos išsivystymo nepastebėta, kultūra buvo tęsiama tol, kol senstančios audinio ląstelės pradės spalvą. Jei mėginys turi būti inkubuojamas per naktį, reikia įpilti pakankamai -galaktozidazės dažymo tirpalo, kad dažymo tirpalas neišgaruotų ir neišdžiūtų tabletės.

(5) Po to, kai audinys įgijo spalvą, dažymo tirpalas buvo pašalintas, o sekcijos panardintos į PBS ir du kartus plaunamos, o po to panardintos į gryną vandenį ir du kartus plaunamos.

(6) (neprivaloma) Įpilkite „Nuclear Fast Red“ tirpalo (Rekomenduojamas G1035) 3 minutes ir skalbkite 3 kartus.

(7) Sekcijos buvo 2 kartus dehidratuotos absoliučiu etanoliu, po to kiekvieną kartą 5 minutes skaidrios ksilenu, o po to užsandarintos neutraliu gumos lašeliu.

3. Dažymo rezultatai

Senstančių ląstelių citoplazma yra išsklaidyta mėlynai.

1. Prieš naudojimą X-Gal tirpalas turi būti atšildytas ir visiškai sumaišytas kambario temperatūroje.

2. -Galaktozidazės dažymo tirpalai A ir B prieš naudojimą turi būti atstatyti iki kambario temperatūros, o paruoštą dažymo tirpalą prieš naudojimą kruopščiai sumaišyti be nuosėdų.

3. Senstančių ląstelių dažymo galaktozidaze reakcija priklauso nuo specifinių pH sąlygų, todėl jos negalima inkubuoti CO.₂inkubatorius spalvai sukurti, kitaip tai paveiks dažymo tirpalo pH ir sukels dažymo gedimą.

4. Ruošdami dažymo tirpalą, rinkitės eksploatacines medžiagas iš polipropileno (PP) arba stiklo, o ne iš polistireno (PS).

5. Spalvos raida turėtų būti stebima kelis kartus per 2 val. per naktį spalvos raidos laikotarpį, per trumpas laikas gali sukelti neigiamų rezultatų; per daug laiko gali sukelti klaidingus teigiamus rezultatus. Chromogeninis laikas yra glaudžiai susijęs su -galaktozidazės kiekiu pačiame mėginyje.

6. Prieš ruošdami dažymo tirpalą, patikrinkite dažymo tirpalo A pH vertę. Jei ji nėra 6.0 (kuri gali pasikeisti dėl laikymo sąlygų), nustatykite pH vertę iki 6.{{4} } prieš naudojimą su HCl arba NaOH.

7. -Galaktozidazės audinių pjūvių dažymas reikalauja didelio mėginių paruošimo, kurį reikia laikyti -80 laipsnio temperatūroje ir kuo greičiau ištirti. Kadangi -galaktozidazę labai lengva inaktyvuoti, netinkamas mėginio laikymas arba per ilgas mėginio laikymas gali sukelti fermento inaktyvavimą, tada nebus teigiamo dažymo.

8. Darbo metu dėvėkite laboratorinį chalatą ir vienkartines pirštines

Vaizdai:

Fig.1WI-38 ląstelės buvo nudažytos -galaktozidazės rinkiniu. Kairiajame paveikslėlyje pavaizduotos senstančios WI-38 ląstelės, neturinčios dalijimosi ir dauginimosi galimybių, bet vis dar gyvos. Po dažymo teigiamai dažytos ląstelės buvo daugiau nei 95%. Dešinėje esančiame paveikslėlyje pavaizduotos naujai gaivintos WI-38 ląstelės (ankstyvasis pasėjimas), kurių pasėjimai buvo mažiau nei 3, o po dažymo nėra akivaizdžių teigiamų ląstelių.

Tik tyrimams!

Populiarus Žymos: senėjimo ląstelių - galaktozidazės dažymo rinkinys, Kinijos senėjimo ląstelių - galaktozidazės dažymo rinkinio gamintojai, tiekėjai, gamykla