T7 didelio našumo transkripcijos rinkinys

 

Produkto pavadinimas	Katė Nr.	Spec.
T7 didelio našumo transkripcijos rinkinys	G3021-50T	50 T

 

 

T7 High Yield Transcription Kit yra visa sistema, skirta efektyviai RNR sintezei, skirta blot in situ hibridizacijos zondams, ribonukleazės apsaugos tyrimams, po transkripcijos modifikacijoms, įskaitant RNR sujungimą ir poliadenilinimą, ir in vitro transliacijai. T7 RNR polimerazė yra labai specifinė savo promotoriui ir transkribuos didelius RNR kiekius iš DNR sekų (pavyzdžiui, plazmidžių, polimerazės grandininės reakcijos (PCR) fragmentų arba sintetinės DNR) pasroviui nuo savo promotoriaus,

Reakcijos sistemoje 1 ug šablono įvesties gali pagaminti daugiau nei 100 ug RNR, kuri yra tinkama įvairaus ilgio RNR paruošimui.

 

 

 

Laivas su šlapiu ledu; Laikyti -20 laipsnių temperatūroje, galioja 12 mėnesių.

 

 

Komponento numeris	Komponentas	G3021-50T
G3021-1	T7 RNR transkripcijos fermentų mišinys	200 μL
G3021-2	5×T7 transkripcijos reakcijos buferis	250 μL
G3021-3	25 mM NTP mišinys	100 μL
G3021-4	DNazė I	50 μL
G3021-5	Vanduo be nukleazių	1 ml
G3021-6	Valdymo šablonas (0,5 ug/μL)	10 μL
vadovas		Viena kopija

 

 

1. Paruošimas šablonui:

a. Plazmidė, turinti T7 promotorių: norint gauti konkretaus ilgio RNR, plazmidė turi būti visiškai tiesizuota ir išgryninta kaip šablonas. Plazmidės linealizavimas restrikcijos fermentu turėtų sudaryti 5' iškyšą arba buką galą (venkite 3' išsikišusio galo). Rekomenduojamas šablono kiekis vienai reakcijai yra ~1 ug;

b. PGR produktas arba sintetinė DNR: nekoduojančios grandinės pradmens 5' galas, sujungtas su seka iš T7 promotoriaus (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'), atlieka PGR amplifikaciją. PGR produktai gali būti tiesiogiai naudojami kaip transkripcijos šablonai be gryninimo, tačiau po valymo RNR išeiga padidės. Rekomenduojamas šablono kiekis vienai reakcijai yra ~0,5 ug.

2. In vitro transliacijos reakcija:

a. Į sterilų, be nukleazės esantį mėgintuvėlį ant ledo nurodyta tvarka įpilkite šį komponentą

b. Švelniai išmaišykite ir trumpai centrifuguokite.

c. Inkubuokite 37 laipsnių temperatūroje 2 valandas. (Reakcijos trukmę reguliuokite pagal tikslinį ilgį ir norimą RNR išeigą. Pavyzdžiui, RNR mažesnė nei 300 nt, rekomenduojama inkubuoti 4 valandas ar ilgiau).

Komponentas	Suma	Galutinė konc.
Šablonas	0.5-1 ug	25-50 µg/mL
5×T7 transkripcijos reakcijos buferis	4 μL	1×
25 mM NTP mišinys	2 μL	2,5 mM
T7 RNR transkripcijos fermentų mišinys	4 μL
Vanduo be nukleazių	Iki 20 μl	--

3. Gydymas DNaze I

Po reakcijos įpilkite 1 μL DNazės I, trumpai sumaišykite ir inkubuokite 37 laipsnių temperatūroje 15 minučių.

4. Transkripcijos produktų kiekybinis įvertinimas

a. Gelio elektroforezės analizė

Rekomenduojamas 1 % denatūruojantis formaldehido agarozės gelis.

b. UV absorbcijos metodas

RNR produktų koncentracija, nustatyta UV absorbcijos įranga po valymo (laisvi nukleotidai turės įtakos kiekybinio nustatymo tikslumui).

 

 

1. Dėvėkite tinkamas pirštines ir kaukes bei naudokite vienkartines RNazės neturinčias eksploatacines medžiagas, kad išvengtumėte RNazės užteršimo.

2. Norėdami paruošti pažymėtą RNR, pakeiskite rinkinyje esantį NTP mišinį atitinkamu reagentu.

3. Kontrolinio šablono transkripcijos ilgis rinkinyje buvo 500 nt.

4. Dėl savo saugumo ir sveikatos dėvėkite apsauginius akinius, pirštines arba apsauginius drabužius.

 

Tik tyrimams!

 

 

Populiarus Žymos: t7 didelio našumo transkripcijos rinkinys, Kinijos t7 didelio našumo transkripcijos rinkinio gamintojai, tiekėjai, gamykla