BCA baltymų kiekybinio nustatymo rinkinys

Bredfordo ir BCA metodai yra dažniausiai naudojami kiekybinio baltymų koncentracijos nustatymo metodai. BCA baltymų kiekybinio aptikimo rinkinys yra su plovikliu suderinama formulė, pagrįsta bicinchonino rūgštimi (BCA), skirta kolorimetriškai aptikti ir nustatyti bendrą baltymų kiekį. Šis metodas apjungia gerai žinomą Cu2+ redukavimą į Cu+ baltymu šarminėje terpėje (biureto reakcija) su labai jautriu ir selektyviu vario katijono (Cu+) kolorimetriniu aptikimu naudojant unikalų reagentą, kuriame yra bicinchonino rūgšties. . Violetinės spalvos šio tyrimo reakcijos produktas susidaro chelatuojant dviem BCA molekulėms su vienu vario jonu. Šis vandenyje tirpus kompleksas pasižymi stipria absorbcija esant 562 nm, kuri yra beveik tiesinė, didėjant baltymų koncentracijai plačiame darbo diapazone (50–2000 µg/mL).

Šiam metodui įtakos neturi cheminės medžiagos ir didelė ploviklio koncentracija daugumoje mėginių, įskaitant 5 % SDS, 5 % Triton X-100 ir 5 % Tween-20, 60, 80 ir kt. Tačiau kompleksonas sudaro agentas ir didelės koncentracijos reduktorius turės įtakos aptikimo rezultatams. Taigi, būtina užtikrinti, kad mėginyje nebūtų EGTA, EDTA koncentracija būtų mažesnė nei 10 mM, o DTT ir -merkaptoetanolio koncentracija būtų mažesnė nei 1 mM. Jei mėginyje yra kompleksonų arba reduktorių, apsvarstykite Bradfordo baltymų kiekybinio nustatymo rinkinį (G2001).

Siunčiame kambario temperatūroje; Baltymų standarto (BSA) saugykla 2-8 laipsnio, galioja 12 mėnesių. Standartinis baltymų tirpalas turi būti laikomas -20 laipsnių temperatūroje ir sunaudotas per 6 mėnesius. Likę reagentai laikomi kambario temperatūroje, galioja 12 mėnesių.

1. Baltymų standartinio laikymo tirpalo paruošimas: į baltymų standartinį mėgintuvėlį (BSA) įpilkite 1 mL baltymų standartinio skiediklio tirpalo ir 25 mg baltymų standarto visiškai ištirpinkite, kad gautumėte 25 mg/mL koncentracijos baltymų standartinį laikymo tirpalą. Standartinis baltymų laikymo tirpalas gali būti laikomas ilgą laiką esant -20 laipsniui;

2. Baltymų standartinio darbinio tirpalo paruošimas: 25 mg/ml baltymų standartinis laikymo tirpalas praskiedžiamas 5 0 kartus PBS arba normaliu fiziologiniu tirpalu, kad gautų baltymų standartinį darbinį tirpalą, kurio galutinė koncentracija yra 0,5 mg/ml. Siekiant užtikrinti tikslumą, atkreipkite dėmesį į 10 kartų gradiento skiedimo metodą.

3. Standartinė kreivė (Mikroplokštelės procedūra): Baltymų standartinis darbinis tirpalas buvo įpiltas į 96-šulinėlių plokštelę 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 ir 20 μL, o tada aukščiau pateiktas gradiento darbinis tirpalas buvo papildytas iki 20 μL, pridedant 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 ir 0 μL su PBS arba fiziologiniu fiziologiniu tirpalu, kad būtų gautos gradiento kreivės, kai baltymų koncentracija yra 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 ir 500 ug/mL tokia tvarka . Gradiento kreivės gautos 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ug/ml.

4. Tyrimo ėminio paruošimas: tiriamasis mėginys tinkamai atskiedžiamas (atliekant aptikimą prieš tyrimą, baltymų koncentracija tiriamajame mėginyje yra standartinės kreivės ribose, siekiant užtikrinti, kad aptikimo rezultatai būtų patikimi) ir pipete įlašinkite po 20 µL kiekvieno tiriamojo mėginio į 96-šulinėlių plokšteles. Bandomasis mėginys ir baltymų standartinis darbinis tirpalas skiedžiami tuo pačiu tirpalu.

5. BCA darbinio tirpalo paruošimas: 50 dalių BCA reagento sumaišymas su 1 dalimi vario sulfato tirpalo (50:1, BCA reagentas: vario sulfato tirpalas). BCA darbinį tirpalą galima laikyti kambario temperatūroje ir sunaudoti per 24 val. Į kiekvieną šulinėlį įpilkite 200 µL BCA darbinio tirpalo. Norint išvengti atliekų, rekomenduojama paruošti pagal poreikį.

6. Aptikimas: į kiekvieną šulinėlį įpilkite 200 µL BCA darbinio tirpalo ir 30 sekundžių kruopščiai maišykite plokštelę ant plokštelės kratytuvo; Uždengus dengiamąją plokštę ir inkubavus 37 laipsnių temperatūroje 30 minučių, standartinė kreivė Nr. 0 buvo naudojama kaip atskaitos taškas, matuojant sugertį ties 562 nm arba arti jos plokštelių skaitytuvu. (Pastaba: galima reaguoti ir kambario temperatūroje 2 val. arba 60 laipsnių 30 min. Jei baltymų koncentracija maža, rekomenduojama reaguoti 60 laipsnių temperatūroje)

7. Skaičiavimas: standartinė kreivė buvo nubrėžta su gradiento baltymų kiekiu (ug/mL) kaip abscisėmis ir absorbcijos verte kaip ordinate. Pagal tiriamojo mėginio absorbcijos vertę tiriamojo mėginio baltymų koncentraciją (ug/mL) atitinkamoje duobutėje galima rasti standartinėje kreivėje, o tada, padauginus iš mėginio praskiedimo koeficiento, gaunamas tikrasis baltymas. bandinio koncentracija.

1. Baltymų koncentracijos nustatymui BCA metodu didelę įtaką daro temperatūra ir laikas, o absorbcijos vertė keisis ilgėjant laikui arba kylant temperatūrai. Jei spalvinės reakcijos laiko ir temperatūros negalima tiksliai kontroliuoti, kiekvienam nustatymui rekomenduojama sudaryti standartinę kreivę.

2. Ruošiant standartinį baltymų laikymo tirpalą, būtina užtikrinti pakankamą ištirpimą. Ruošiant baltymų etaloninį darbinį tirpalą, rekomenduojamas skiedimas 10 kartų gradientu. Neskieskite 50 kartų vienu metu, kad išvengtumėte klaidų.

3. Siekiant užtikrinti baltymų kiekybinį įvertinimą, geriau pasirinkti tą patį buferinį tirpalą mėginio ekstrakcijai ir baltymų standartiniam skiedimui, kad būtų užtikrintos vienodos aptikimo sąlygos. Jei buferio foninė vertė yra didelė, rekomenduojami kiti metodai.

4. Dėl savo saugumo ir sveikatos dėvėkite apsauginius akinius, mūvėkite pirštines arba dėvėkite apsauginius drabužius.

Tik tyrimams!

Populiarus Žymos: bca baltymų kiekybinio aptikimo rinkinys, Kinijos bca baltymų kiekybinio aptikimo rinkinio gamintojai, tiekėjai, gamykla